Többek között az eddig felfedezett peptidhormonok példája is tanúsitja, hogy a hosszabb-rövidebb peptidek az élő szervezetben számos fontos funkciót láthatnak el. Feltehető, hogy ezeknek a biológiailag aktív, és potenciális terápiás hatással bíró peptideknek eddig csak egy kis töredékét ismerjük. Ez indokolja, hogy ezen a területen világszerte és hazánkban is, intenzív kutatómunka folyik.
     Az újfajta biológiai hatással rendelkező peptidek felkutatására kétféle elvi lehetőség kínálkozik:
               1. A peptidek izolálása az élő szervezetből, előzetesen felismert biológiai hatásuk alapján.
               2. A peptidek szintetikus előállitása és biológiai hatásaik utólagos felderitése.
Eddig az izolálásos módszer bizonyult járhatóbbnak annak ellenére, hogy ez igen munkaigényes. Ennek az a magyarázata, hogy az adott tagszámú peptidek lehetséges száma olyan gyorsan nő a tagszámmal, hogy már a tetrapeptidek teljes számban (160 ezer) történő előállítása is a gyakorlatban megoldhatatlan feladatnak tűnik. Ha 20 féle fehérjealkotó aminosavat veszünk alapul, a lehetséges peptidek számát (N_n) a következö egyenlet fejezi ki a tagszám (n) függvényében:

     Ha a peptideket lépésenként és egymástól függetlenül állitjuk elő, az n tagú peptidek esetében az ehhez szükséges szintetikus lépések száma (S_n) a következőképpen adódik:

Megjegyzendő, hogy a szintetikus lépésen most és az elkövetkezőkben is egy teljes kapcsolási ciklust értünk, tehát a kapcsolási lépésen kívül beleértjük a védőcsoportokkal kapcsolatos műveleteket is.

     Jó szervezéssel, azaz szisztematikus módon eljárva a szintézisnél, a szintetikus lépések száma csökkenthető. A minimálisan szükséges lépésszám:

     Az előállitott peptideket hatásvizsgálatnak kell alávetni, ami szintén reménytelenül nagy szám, hiszen minden peptidet több féle hatásra kell tesztelni. Ha e tesztek fajtáinak számát t-vel jelöljük, a szükséges hatásvizsgálatok teljes számát (T_n) a következő egyenlet fejezi ki:

Az 1. táblázatban találjuk felsorolva a különböző tagszámú peptidek lehetséges számát, a szintézisükhöz szükséges lépésszámot, valamint a tesztek számát, 10 különböző hatásvizsgálattal számolva (t=10). A feltüntetett értékek kerekítve vannak. A felsorolt számokból világosan kitűnik, hogy szinte reménytelen dolog már a tripeptidek teljes számban történő előállítására és tesztelésére vállalkozni.
 
 

     A lehetséges peptidek nagy száma miatt lépésenkénti szintézissel már a kis tagszámú peptidek teljes számban történő előállitására sem lehet vállalkozni. További problemát jelent a szükséges teszvizsgálatok nagy száma a biológiailag hatásos molekulák kiválasztása céljából. Ezen a szinte reménytelen helyzeten próbál valamelyest javítani a következőkben előterjesztendő javaslat.

Kistagszamú, biológiailag aktív peptidek szisztematikus felkutatása, peptid-keverékek szintézise és aktivitásvizsgálata útján

     Az alább ismertetendő javaslat tulajdonképpen egy kutatási terv, amelynek révén az eddigieknél sokkal nagyobb eséllyel lehet vállalkozni biológiailag aktív peptidek felkutatására. Amikor ezt a tervet leírom, teljesen tudatában vagyok annak, hogy e terv végrehajtásának milyen nagy ipari jelentősége lehet. Az is világos, hogy megvalósítása csak több intézmény együttműködése esetén lehetséges. Elsősorban a gyógyszeripar közreműködése kívánatos, hiszen a befektetések a gyógyszeripar révén térülhetnek meg.
     A kutatási javaslat lényege az, hogy a peptideket nem egyenként szintetizáljuk, hanem olyan peptidkeverékeket állítunk elő amelyek több száz, vagy több ezer peptidet tartalmaznak nagyjából azonos molarányban és ezeket a keverékeket vetjük alá hatásvizsgálatoknak. Amint látni fogjuk ezen az úton a szintéziseknél és a hatásvizsgálatoknál egyaránt nagyon sok munkát lehet megtakarítani. Az elsö közelítés során csak annak megállapítása a cél, hogy a kérdéses peptidkeverék mutat-e valamilyen biológiai hatást. Ha észlelünk hatást, természetesen el kell tudni dönteni azt, hogy az aktivitás a peptidkeverék mely komponensétől (vagy mely komponenseitől) származik

A peptidkeverék szintézisének módszere.

    Minthogy nem egyes peptidek hanem peptidkeverékek szintéziséről van szó, ezek utólagos tisztitása a melléktermékektől, nem jöhet szóba. Ezért a klasszikus módszer sem jöhet szóba. A peptidkeverék szintézisénél a szilárdfázisú módszert kell alkalmazni. Már itt megemlítjük, hogy a szintézisnél nem szükségképpen 20 fajta aminosavat használunk. Esetenként használhatunk többet, ha példaul nem szokványos aminosavrészeket is be akarunk építeni, de kevesebbet is, mert például a dekapeptidek esetében már nem törekedhetünk a teljességre, hanem meg kell elégednünk bizonyos tipusú aminosavak szerepeltetésével. Az i-edik pozicióban variálandó aminosavrészek számát k_i-vel jelöljük. A C-terminálison varialándó aminosavrészek száma: k₁; az N-terminálison pedig: k_n.
     A szintézis kivitelezése céljából a felhasználandó gyantát k₁ számú egyenlő mennyiséget tartalmazó adagra osztjuk (annyi adagra ahány fajta aminosavrészt akarunk szerepeltetni a peptidek C-terminálisán). Ezután mindegyik adag gyantára külön-külön felkapcsoljuk a k₁ fajta aminosav valamelyikét, majd eltávolítjuk a mintáról  az amino-védőcsoportot. Mindegyik mintából félreteszünk egy-egy kis adagot később történő felhasználás céljára, majd a mintákat alaposan összekeverjük. Ezután az aminoacil-gyantakeveréket k₂ egyenlő adagra osztjuk és mindegyikre rákapcsoljuk a k₂ féle védett aminosav valamenyikét, majd külön-külön ismét eltávolítjuk az amino-védőcsoportokat. Összekeverés előtt most is félreteszünk egy-egy kis adagot későbbi felhasználás céljára. Az összekevert gyanta kis részletéről lehasítjuk a dipeptidek keverékét biológiai tesztvizsgálatok számára, majd a többit k₃ egyenlő részre osztjuk és felkapcsoljuk a harmadik pozicióban szereplő aminosavakat. Így haladunk tovább a szintézissel mig az n tagot tartalmazó peptidek keverékéhez jutunk el.
     Az elmondottakhoz néhány megjegyzést kell fűzni. Mint közönséges szilárdfázisú szintézisnél, itt is törekedni kell arra, hogy a reagens feleslegének alkalmazásával jó konverziót érjünk el. Szerencsére azonban a nem 100%-os konverzió, vagy kismértékű, nem kivánt hasadásos reakciók nem okoznak olyan komoly problémát  mint a közönséges szintéziseknél. A szintézis munkaigényét jelentősen csökkentené, ha az acilezési reakciókat aktívált aminosavak keverékével lehetne végrehajtani. Ez azonban nem látszik járható útnak az aktívált aminosavak eltérő reaktivtása miatt, ami odavezetne, hogy a peptidkeverék komponensei nagyon eltérő koncentrációban keletkeznének, ami nem engedhető meg, mert zavart okozna a hatásvizsgálatoknál. A peptidek azonos koncentrációban történő képződését a minták mechanikus összekeverésével és egyenlő adagokra történő szétmérésével lehet biztosítani. Így módja van minden aminosavösszetevőnek teljes mértékben elreagálni. Mérlegelendő a továbbiakban, néhány azonos reaktivitású aminosavszármazék keverékével történő acilezés lehetősége is. Kisebb reaktivitási eltéreseket kompenzálni lehetne a keveréket alkotó aminosavszármazékok molarányának alkalmas megválasztásával. A következő számításoknál azonban, több aminosavszármazék keverékével történő acilezés lehetőségét figyelmen kívül hagyjuk.
     A szintézissel előállított peptidek számát, vagyis a peptidkeverék komponenseinek számát, általános esetben a következő képlet szerint számíthatjuk ki:

Ha mindegyik pozicióban ugyanannyi aminosavrészt (k) variálunk,

Az n tagszámú, és N_n komponenst tartalmazó peptidkeverék előállításához szükséges szintetikus lépések száma (külön lépésnek tekintve az első aminosavrész gyantára történő felkapcsolását is):

Ha mindegyik pozicióban k fajta aminosavrészt variálunk,

A fenti képletből kitűnik a peptidkeverék szintézisének előnye: a szintetikus lépések számát a variálandó aminosavrészek számának összeadásával kapjuk, az előállított peptidek számát pedig a variálandó aminosavrészek összeszorzásával.

Egy példa. A 20 féle aminosavrész variálásával előállítható 160000 tetrapeptid keverékének szintéziséhez mindössze 80 szintetikus lépés szükséges!

Megjegyzendő, hogy menetközben előállítottuk az összes négynél kisebb tagszámú peptidet is, tehát a 400 dipeptidet és a 8000 tripeptidet. Ennyi peptid hagyományos módon való előállításához összesen 168400 szintetikus lépésre lenne szükség. Más öszehasonlitás: 80 szintetikus lépéssel, a hagyományos módszerrel, mintegy 30 tetrapeptid szintetizálható.

A peptidkeverékek hatásvizsgálata.

  A peptidkeverékek szintézise első közelítésben annak megállapitása céljából történik, hogy van-e közöttük biológiailag aktív. Abból a feltételezésből indulhatunk ki, amit még kísérletileg is alá kell támasztani, hogy a hatásvizsgálat történhet keverék formájában is. Ez nagy nyereséggel jár a hagyományos módszerhez viszonyitva, hiszen annyiszor kevesebb tesztet kell végrehajtani, ahány peptidet tartalmaz a keverék. Igy például a 8000 tripeptidet tartalmazó keverék elvileg egyetlen tesztsorozattal vizsgálható meg. Ha van közöttük aktív peptid, akkor a t számú teszt valamelyike pozitív eredményt ad. Több aktív peptid jelenléte esetén természetesen több fajta teszt is adhat pozitív eredményt. Az n tagszámú peptidek keverékének szintézisénél célszerű a kisebb tagszámú peptidek keverékét is tesztelni. A szintézis már úgy van tervezve, hogy erre lehetőség nyíljon. Ezt a követelményt is figyelembe véve, a t számú különböző tesztvizsgálat esetén az összes tesztvizsgálatok száma:

 A fenti összefüggés ugyan elvileg kétségtelenül helytálló, azonban a gyakorlati megvalósitásához néhány megjegyzést kell tenni. Minden kétséget kizáróan létezik egy határ, amelyen túl a hatásvizsgálatnak alávetendö peptidkeverékek komponenseinek száma nem növelhető. Hogy ez mennyi, azt kisérletek nélkül nehéz megítélni. A keverék valószínűleg több ezer komponenst tartalmazhat ugyan, mégis úgy ítélhető meg jelenleg, hogy a fentebb kifejtett módszer alkalmazhatóságának inkább a tesztelhetőség szab határt, semmint a szükséges szintetikus lépések száma. Ha a komponensek száma túl nagy a keverékben, túl nagy adagban kell a keveréket alkalmazni, hogy az egyes komponensek hatása észrevehető legyen. Megjegyzendő, hogy a keverék feltehetően számos olyan analógot tartalmaz amely tobbé-kevesbbé hatásos, és ezek hatása feltehetően összegződik. Mindemellett létezik olyan határ, amelyet a komponensek számát illetően nem lehet túllépni. Ezért bizonyos esetekben célravezető lehet, hogy az n tagszámú (tehát az előállítani kívánt legnagyobb tagszámú) peptidek hatásosságát "összekeverés" nélkül vizsgáljuk. Más esetekben a szintézist úgy célszerű tervezni, hogy a komponensek száma ne haladja meg az optimális határt.

Az aktív peptid "visszakeresése".

  Ha kimutattuk, hogy a peptidkeverék tartalmaz aktív komponenst, vagyis a keverék mutat újszerű biológiai hatást, a következő feladat az aktív peptid izolálása és szerkezetének megállapitása, amit a szintézis követ. Ha már egyszer a kezünkben van az aktív komponenst vagy komponenseket tartalmazó keverék, az izolálás történhet a már jól bevált elválasztási módszerekkel is, hiszen ezek lehetővé teszik az aktív vegyület kiválasztását akár több ezer inaktív összetevő közül is. Lehetséges azonban másfajta módszert is követni. Ennek ismertetésére kerül most sor. Ez a közelítés az aktív peptid megismerésére feltehetően kevesebb fáradsággal jár mint az izolálásos módszer, amellett több információval is szolgál, ugyanis egyúttal a szerkezet-hatásösszefüggést is feltérképezi. Alkalmazhatóságának feltétele az, hogy legyen módszerünk az aktivitás kvantitativ meghatározására. Egyszerűség kedvéért tételezzük most fel, hogy keverékünk egyetlen hatásos komponenst tartalmaz (hozzátéve ehhez az ugyanolyan hatást mutató kisebb aktivitású analogokat).

Az 1. visszakeresési lépés.

       Elővesszük azt a k_n db. mintát amit félretettünk az n-tagú peptidek szintézisénél, mielőtt azokat összekevertük volna. Mindegyikről lehasítjuk az n-tagu peptidek keverékét. Ezek a peptidek abban fognak eltérni egymástól, hogy más az n-edik (azaz az N-terminális) aminosavrész. Mindegyik mintát kvantitativ hatásvizsgálatnak vetjük alá. Ez megmutatja, hogy hogyan függ az aktivitás az N-terminális aminosavrésztől, vagyis megállapithatjuk az aktív peptid N-terminális aminosavrészét, és egyúttal azt is, hogy ennek helyettesítése más aminosavrésszel, hogyan befolyásolja az aktivitást. Tételezzük fel például, hogy a legnagyobb aktivitást mutató minta (és így aktív peptidünk) aminoterminálisa: Phe (fenilalanin). Mindjárt megjegyezzük, hogy ha több egyformán nagy aktivitással járó terminális aminosavat találunk (és ez vonatkozik a további visszakeresési lépésekre is) célszerű, ha az aktív peptid N-terminálisaként a legolcsóbb, vagy a legkisebb problémát okozó aminosavat választjuk.

A 2. visszakeresési lépés.

     Ezután elővesszük az n-1 tagú peptidek szintézisénél félretett k_n-1 db. mintát és mindegyikhez külön-külön hozzákapcsoljuk az előzőleg megállapitott aminosavat, példánkban a Phe-t. Ha mindegyik mintáról lehasítjuk a peptideket, ezáltal k_n-1 számú különböző peptidkeverékhez jutunk. Ezekben az a közös, hogy minden peptidnek Phe az N-terminálisa. Ha a peptidkeveréket kvantitativ vizsgálatnak vetjük alá, megállapithatjuk az aktív peptid n-1-edik (vagyis az N-terminális elötti) aminosavrészét. Egyúttal megtudhatjuk, hogy ennek felcserélése más aminosavrészekkel milyen hatást gyakorol az aktivitásra. Tételezzük fel, hogy peptidünk utolsó előtti aminosavrésze Arg (arginin). Megjegyzendő, hogy ennél a visszakeresési lépésnél a Phe-t k_n-1 mintához kellett hozzákapcsolni, és ugyanennyi (tehát k_n-1) esetben kellett hatásvizsgálatot végezni. Ilyenkor már nem végezzük el mind a t féle tesztet, hanem csak azt, amelyik a kérdéses hatásra vonatkozik. Tehát a szintetikus lépések száma és a tesztvizsgálatok száma egyaránt k_n-1. Azt is megjegyezzük, hogy az ezt megelőző visszakeresési lépésnél csak hatásvizsgálat van (k_n számú) szintetikus lépésre nincs szükség.

A 3. visszakeresési lépés.

     Ennél és az ezt követő visszakeresési lépéseknél kétféle utat követhetünk. A szintézis közben félretett mintákban a peptidek tagszámát ki kell egészitenünk n-re, úgy, hogy azok N-terminális szakaszukon az aktivitást biztositó aminosavrészeket tartalmazzák. Ezt kétféle módon valósithatjuk meg. Vagy az aminosavak (példánkban a védett Arg majd Phe) egyenkénti hozzákapcsolásával, vagy az előzetesen megszintetizált, megfelelö szekvenciájú oligopeptid (példánkban a védett Phe.Arg) egy lépésben történő hozzákapcsolásával. A szükséges szintetikus lépések száma a kétféle megoldásnál erősen eltér.Az elvégzendő hatásvizsgálatok száma viszont mindenképpen azonos. Térjünk rá most a 3. visszakeresési lépésre.

A lépésenkénti toldás. Vegyük elö az n-2 tagszámú peptidek szintézisénél félretett k_n-2 számú mintát. Mindegyikhez hozzákapcsoljuk külön-külön elöbb a védett Arg-ot, majd a védett Phe-t. A peptidek lehasítása után mind a k_n-2 db. peptidkeveréket aktivitásvizsgálatnak vetjük alá és megállapitjuk az aktív peptid N-terminálisától számitott harmadik aminosavrészt. Az elvégzendő hatásvizsgálatok száma: k_n-2. A szükséges szintetikus lépések száma: 2k_n-2. A k_i előtti szorzószám annál nagyobb, minél rövidebb peptideket toldunk. A szorzószám megegyezik a hozzátoldandó aminosavrészek számával.

Toldás oligopeptiddel. Előre meszintetizáljuk a védett dipeptidet (példánkban Phe.Arg) és ezt kapcsoljuk a félretett k_n-2 számú minta mindegyikéhez. Ezután úgy járunk el mint fent. A hatásvizsgálatok száma itt is: k_n-2. A szintetikus lépések száma (az oligopeptid szintézisét nem számitva): k_n-2. Ez a megoldás gazdaságosabbnak tűnik. Gyakorlatilag azt jelenti ez, hogy a visszakereséssel párhuzamosan szintetizáljuk az aktív peptidet is mégpedig klasszikus módszerrel az aminoterminális felől indulva. A növekvő peptid kis részletét feláldozzuk az egyes visszakeresési lépéseknél. Nagy előnye ennek a visszakeresési módszernek, azon túl hogy kevesebb szintetikus lépésböl áll, hogy mire a visszakeresési folyamat végére érünk, készen áll a szintetikus aktív peptid is.

Több aktív peptid visszakeresése. A szintetikus peptidkeverékekben több, eltérő hatású aktív peptid is előfordulhat. Ilyenkor a visszakeresési lépések száma annyiszor lesz nagyobb, ahány aktív peptidről van szó. Vagyis, ha "a" számu peptidről van szó, a szintetikus lépések és a hatásvizsgálatok számát úgy kapjuk, ha a fentebb levezetett értékeket szorozzuk a-val. Megjegyzendő, hogy több eltérő hatású peptid egyidejű jelenléte komplikálhatja a visszakeresést, különösen ha ellentétes hatású peptidek is előfordulnak. Ennek részletezésétől azonban eltekintünk.

A visszakeresési folyamat akkor zárul, amikor vagy az oligopeptides, vagy a lépésenkénti toldás alkalmazásával valamennyi aktív peptid szekvenciáját megállapitottuk.

A szintetikus lépések számának és a hatásvizsgálatok számának összegezése a teljes szintetikus és visszakeresési folyamatra
 
 

A szintetikus lépések száma oligopeptides toldásnál

         Szintézisnél

          Visszakeresésnél

        Szintezisnél és visszakeresésnél összesen:

        Ha mindegyik lépésben k aminosavat variálunk

 A szintetikus lépések száma lépésenkénti toldásnál.

        Szintézisnél

        Visszakeresésnél

        Szintézisnél és visszakeresésnél összesen:

        Ha mindegyik lépésben k aminosavat variálunk:

A hatásvizsgálatok száma, amely egyaránt érvényes oligopeptides és lépésenkénti toldásnál.

         Szintezisnél

         Visszakeresésnél

        Szintezisnél és visszakeresésnél összesen

        Ha mindegyik lépésnél k aminosavat variálunk:

 Egy péda: az összes pentapeptid előállítása és hatásvizsgálata.

                                       N₅ = 3200000,      n=5 k=20     t=10    a=1

         Szintetikus lépések száma összesen

                                          Oligopeptides toldással            180
                                          Lépésenkénti toldással             300
                                          Tesztek száma                         140
 

A módszer kiterjesztése más vegyülettipusokra

  Az előzőekben kifejtett módszer nemcsak aktív peptidek szisztematikus felkutatására alkalmas. Ugyanaz az elv minden más szekvenciális felépitésű vegyülettipusra érvényes, vagyis amikor az egymáshoz sorban kapcsolódó épitőelemek minőségében és sorrendjében különböznek egymástól. Ezek közöt lehetnek természetes vegyületek például oligoszacharidok, vagy oligonukleotidok, de elképzelhetők mesterséges vegyületek is. Ez utóbbiak esetében szekvenciális kopolimer tipusú vegyületek jöhetnek számitásba, vagy szekvenciális polikondenzátumok.
 
 
 

                                                                                            Dr. Furka Árpád
                                                                                              egyetemi tanár
 

36327/1982.ügyszám

Tanúsitom, hogy ezt a 14. azaz Tizennégy oldalból álló összefűzött okiratot dr. Furka Árpád egyetemi tanár Budapest VII., Csengery utca 23. III.2.szám alatti lakos előttem sajátkezűleg irta alá.-----------------------------------------------------------------------------------
Budapest, 1982. Ezerkilencszáznyolcvankettő évi junius ho 15. (Tizenötödik) napján.-----

                                                                                                    Dr. Bókai Judit
                                                                                                   Állami közjegyző